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Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)含量

更新時間:2016-07-15 點擊次數(shù):8492

Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)含量

 

一、實驗原理

  蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(—CO—NH),因此有雙縮脲反應(yīng),在堿性溶液中,能與CU2+  形成絡(luò)合物。Folin-酚試劑反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上,引進Folin試劑(磷鉬酸-鎢酸試劑),蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑,生成藍色物質(zhì)。在一定條件下,藍色強度與蛋白質(zhì)的量成正比例。

   本法的優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高、較此外吸收法靈敏10~20倍,較雙縮脲法靈敏100倍,反應(yīng)約在15min內(nèi)有zui大顯色,并至少可穩(wěn)定幾小時。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的基團,Tris.HCL緩沖劑以及蔗糖、硫酸銨、巰基化合物,酚類及檸檬酸,均對此反應(yīng)有干擾作用。在測試時應(yīng)排隊干擾因素或做空白實驗消除。含硫酸銨的溶液只需加濃Na2CO3-NaOH溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后色淺,則必須將Na2CO3-NaOH溶液的濃度提高1~2倍。

   本法可測定范圍是25~250µg蛋白質(zhì)。          

二、實驗用品

(一)器材

 (1)722型分光光度計。

     (2)恒溫水浴鍋。

     (3)試管及試管架。

     (4)0.5ml,1ml及5ml移液管

  • 試劑

   (1)試劑甲。

   (A)4%Na2CO3溶液;

   (B)0.2mol/LNaOH溶液

   (C)2%酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀、酒石酸鈉);

   (D)1% CuSO4.5H2O溶液;

     臨用前將(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(體積比)混合,此混合液即為試劑甲。混合后的溶液1d內(nèi)有效。

(2) Folin-酚試劑(試劑乙):在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O),25g鉬酸鈉((Na2MoO4.2H2O),及700ml蒸餾水,50ml 85%磷酸,100ml濃鹽酸充分混合,燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆,以防溶液溢出,接上回流冷凝管以文火回流10h?;亓鹘Y(jié)束后,加入150g硫酸鋰(LiSO4),50m重蒸水及數(shù)滴液溴,開口繼續(xù)沸騰15min,以除去多余的溴。冷卻后溶液呈金黃色(如果仍呈綠色,須再重復(fù)滴加溴水的步驟),定容至1L,過濾,濾液置棕色瓶中保存,可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久,顏色由黃變綠,可加幾滴液溴,煮沸數(shù)分鐘,恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定酸度,以酚酞為指示劑。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右,將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度使用,即為Folin-酚試劑。

(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:可用結(jié)晶牛血清蛋白,預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量,再根據(jù)其純度配制成500µg蛋白/ml溶液。

(三)材料

     血清使用前稀釋100倍或約含20~250µg蛋白/ml溶液。

 

三、實驗程序

    一、操作方法

 1.蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 

   取14支試管,分兩組按表9-1平行操作。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以OD650值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白量為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

2.樣品溶液蛋白質(zhì)濃度測定

  取6支試管,分兩組,按表9-2平行操作。

3、計算

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